糖在生命活动中扮演着能量供给、细胞信号传导、免疫识别等至关重要的角色，其多维功能依赖于其独特的立体结构。然而，与核酸和蛋白质相比，糖的结构与功能研究相对滞后。这主要是由于单糖分子类型多样，具有多个手性中心，形成聚糖时糖苷键连接方式复杂多变，且结构高度柔性，使得其高分辨率三维结构的解析异常困难，严重限制了我们对其结构与功能的深入理解。颜宁团队为此提出 CryoSeek（酷寻）研究策略，将冷冻电镜（Cryo-EM）作为面向未知生物大分子的发现工具，开启了以结构为先导的“正向结构生物学（forward structural biology）”范式[1,2,3,4]。通过对清华荷塘（Tsinghua Lotus Pool, TLP）环境样品的解析，该团队成功鉴定出 TLP 系列糖纤维。该系列研究不仅揭示了聚糖在生物大分子组装中的核心作用，也为天然糖质的三维结构高通量解析及糖质测序提供了基于多学科交叉的新路径。进一步，颜宁团队与胡名旭团队合作，通过开发大规模图像分类算法与人工智能糖质建模算法，显著提升了CryoSeek策略的通量，解析了大量环境糖质纤维的结构，并构建了CryoSeek数据库（https://cryoseek.org）[5]。

然而，在利用冷冻电镜解析结构时，会面临一个根本性挑战：冷冻电镜成像丢失了结构的“绝对手性”信息，这导致最终重构得到的三维密度图存在“镜像颠倒”的两种可能。对于蛋白质，科学家可利用其α-螺旋均为右旋这一先验知识来校正。但糖质纤维主要由糖构成，不含α-螺旋，且自然界同时存在D型和L型糖，因此即使达到原子分辨率，也无法直接判断绝对手性。这一不确定性如同失去了“地图的南北方向”，使得构建正确的原子模型寸步难行。此前，解决该问题的经典方法是“倾转对”成像技术[6]，但它需要预先知道样品的参考结构，并对同一区域进行两次成像，流程复杂、成本高昂。对于从自然水体等环境中直接获取的、可能包含上百种不同糖质纤维结构的高异质性样品而言，传统方法难以应用。

北京时间2026年2月26日，胡名旭、王佳伟、颜宁及其团队成员在PNAS上共同发表了“冷冻电子显微学中自然来源糖质纤维的绝对手性确定”（Absolute hand determination of glycofibrils from natural sources in cryo-EM）的研究论文。

为破解环境糖质纤维绝对手性判定难题，研究团队合作开发了名为Ahaha（Absolute hand determination of helical assembly）的新方法。该方法仅需在单角度倾斜的情况下进行常规的冷冻电镜成像，即可高效、准确地判定天然来源糖纤维的绝对手性，目前，该方法已开通在线服务（图1）。

图1. Ahaha的在线服务页面（https://cryoseek.org/ahaha）

图2. Ahaha决定手性的原理示意图

Ahaha的原理如图2所示。互为镜像的螺旋结构（图2b），在相同的倾角（例如+20°）下具有不同的投影（图2c），而在相反的倾角（例如+20°和-20°）下具有相同的投影（图2c）。由此可知，得到相同的投影图像时，不同手性的螺旋应当具有相反的倾角。另一方面，由于螺旋结构的糖质纤维必然平躺在样品平面，其倾斜角度必然平行于样品本身。通过分析高分辨率螺旋重构中的颗粒倾斜角与样品本身的倾斜角是否一致，可以决定重构的高分辨率密度图的手性是否正确（图2d）。当颗粒倾斜角大致平行于给定的样品倾斜角时，则认为所重构的螺旋的手性是正确的，反之，则认为所重构的螺旋的手性是相反的。同时，作为Ahaha分析的一个补充，可以使用颗粒的离焦参数（例如从CryoSPARC的patch CTF中获得）交叉验证给定的样品倾斜是否正确（图2a）。

图3. 使用菌毛样螺旋结构验证Ahaha的正确性

为验证Ahaha的正确性，研究团队使用了一个天然淡水样本（喀斯特洞穴中的石笋滴水）中发现的三种菌毛样（pilus-like）结构进行验证。图3中的三行分别对应于菌毛样-α、菌毛样-β和菌毛样-γ的螺旋结构，这些结构的主要成分都是由蛋白质构成。其密度图及其镜像对称如图3a所示。其中，左侧的结构具有正确绝对手性，因其蛋白的α-螺旋为右手螺旋。密度图中的α-螺旋区域以放大视图展示，并叠加了原子模型。另一方面，Ahaha分析的结果如图3b所示。Ahaha会根据颗粒的倾斜角以及颗粒朝向与倾转轴方向的夹角绘制热力图，同时检查颗粒的倾斜角是否与所给定样品的倾斜角一致。左、右两侧热图分别对应于手性正确和手性错误的密度图。正的倾斜值（绿色）与样品台倾斜方向一致，而负的倾斜值（红色）与样品台倾斜方向相反。可以看到，对于正确绝对手性的螺旋重构结果，Ahaha给出的热力图中的颗粒分布集中于绿色区域，说明Ahaha对于螺旋的绝对手性判定结果也是正确。反之，Ahaha给出的热力图中的颗粒分布集中于红色区域，说明Ahaha的绝对手性判定结果是相反。

图4. (A) 使用Ahaha决定四种自然来源糖质纤维的绝对手性。对于一对镜像对称的螺旋结构，Ahaha给出的热力图中绿色区域占主导则说明Ahaha判定该结构的绝对手性是正确的。(B) 具有正确绝对手性的结构，其相邻两个螺旋单元，及螺旋对称参数。

利用Ahaha，研究团队成功对同一个天然淡水样本中发现的四种糖质纤维完成了绝对手性判定（图4A）。作为对照验证，当研究团队在进行螺旋重构时，若使用镜像对称的初始模型和相反的螺旋转角（twist）参数，则螺旋重构会给出镜像对称即绝对手性相反的结构，此时Ahaha给出的分析结果也是相反的，进一步验证了其正确性。

图5. 糖质纤维的原子模型

根据Ahaha的分析结果，研究团队进一步构建了其精确的原子模型（图5）。该图展示了与丝氨酸或磷酸丝氨酸连接的单糖链。灰色箭头指示由二肽重复序列构成的线性肽链，其N端/C端通过观察氨基酸羧基中的氧原子位置进行推断，最终确认仍需更高分辨率的密度图。虚线框内示意图展示了线性肽链的组成及O-糖基化位点。SA作为统称，代表丝氨酸/苏氨酸-丙氨酸/甘氨酸可能组成的二肽组合。受限于分辨率，模型中所包含的糖分子类型仅为当前条件下的最优近似。在密度图无法为特定糖类型提供明确证据的情况下，研究团队选择甘露糖作为默认糖型。这些模型搭建结果标志着我们对糖这一生命“暗物质”的结构研究迈入了实质性的新阶段，有望加速推动糖生物学领域的突破性发现。

深圳医学科学院特聘研究员胡名旭，清华大学生命学院副教授王佳伟，深圳医学科学院创始院长、深圳湾实验室主任颜宁，为论文的共同通讯作者。深圳医学科学院张起博士是该文的第一作者。覃兰菊、王彤彤博士、李张强助理研究员、张毅琳、陈晟博士、戈其珺、文佳玲为研究工作做出了重要贡献。研究受到深圳医学科学院、国家自然科学基金、北京生物结构前沿研究中心资助。

参考文献：

[1] Wang, T., Li, Z., Xu, K., Huang, W., Huang, G., Zhang, Q. C., & Yan, N. (2024). CryoSeek: A strategy for bioentity discovery using cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences, 121(42), e2417046121.

[2] Wang, T., Huang, W., Xu, K., Sun, Y., Zhang, Q.C., Yan, C., Li, Z., & Yan, N. (2025). CryoSeek II: Cryo-EM analysis of glycofibrils from freshwater reveals well-structured glycans coating linear tetrapeptide repeats, Proceedings of the National Academy of Sciences, 122(1), e2423943122.

[3] Wang, T., Sun, Y., Li, Z., & Yan, N. (2024). The 8-nm spaghetti: well-structured glycans coating linear tetrapeptide repeats discovered from freshwater with CryoSeek. bioRxiv, 2024-12.

[4] Li, Z., Wang, T., Sun, Y., Xu, K., Huang, W., Zhang, Q., Yan. C., Hu, M., Yan, N. (2024) CryoSeek identification of glycofibrils with diverse compositions and structural assemblies. bioRxiv, 2025-10.

[5] Hu, M., Chen, S., Wang, T. , Qin, L. , Zhang, Q. , Zhang, Y., Ge, Q., Chen, T., Li, M., Li, C., Xu, G., Gui, Q., Li, Z. , Yan, N. (2025). CryoSeek identification of glycofibrils with diverse compositions and structural assemblies. LTS Preprint Server, 2025-11.

[6] Rosenthal, P., & Henderson, R. (2003). Optimal Determination of Particle Orientation, Absolute Hand, and Contrast Loss in Single-particle Electron Cryomicroscopy. Journal of Molecular Biology, 333(4), 721–745, 2023-10.