糖生物学是生命科学业界长期公认的未被研究清楚的“暗物质”(Dark matter) 领域，其重要性毋庸置疑。除了糖类分子是生命的重要能量来源，糖基化也是重要的翻译后修饰 (Posttranslational modifications, PTM) 形式之一，可显著扩展蛋白质的功能多样性。糖基化蛋白参与多种生命过程，如信号传导、免疫反应和细胞分化等。

但糖分子内在的分子复杂性阻碍了人们对它进行系统性研究。这是由于单个糖环是建立在sp³杂化碳原子的基本骨架上，与采用sp²杂化形式的多肽/蛋白质相比，它们具有更高的立体化学自由度。此外，当糖分子成环时，它们可以采用多种构型，并涉及多种键连模式，从而导致高度的结构异质性。这些因素综合起来，给人们分析含糖生物结构带来了很大的挑战；而缺乏结构信息，又大大限制了人们去理解糖分子类群的功能。

图1. 糖生物学是有待进一步探索的重要方向

2024年3月28日，颜宁/闫创业/潘俊敏课题组合作在《细胞》(Cell) 杂志在线发表了题为“结构引导发现天然纤绒毛中的蛋白质和聚糖组分”(Structure-guided discovery of protein and glycan components in native mastigonemes) 的研究论文，报道了从莱茵衣藻纤毛中分离的天然纤绒毛 (Mastigoneme) 3.0 Å分辨率的冷冻电镜结构。

纤绒毛是从纤毛膜向外延伸的一种纤细结构。研究发现，纤绒毛主体形成超级螺旋排布，每个旋转螺旋由四对反平行的纤绒毛样蛋白1 (Mastigoneme-like protein 1, Mst1) 组成。Mst1含有II型多聚羟基脯氨酸 (Hyp) 螺旋二级结构 (PPII)，该二级结构被大量阿拉伯糖聚糖包被。此外，结合冷冻电镜密度、蛋白质质谱和生信分析，研究人员鉴定出Mastigoneme的新核心组分——纤绒毛轴心蛋白 (Mastigoneme-specific axial protein, Mstax)，其同样富含大量复杂糖基化修饰，并含有PKD2样跨膜结构域。Mstax具有近8,000个氨基酸残基，从纤毛膜区域延伸到纤绒毛的远端，作为整个Mastigoneme组装的骨架分子。该研究为理解天然生物架构 (Bio-architectures) 中蛋白质和糖类分子形成复合物的相互作用模式提供了理论基础。

研究显示，Mst1蛋白1,854-1,932的片段是富含Ser-Pro重复序列的PPII 螺旋。电镜密度显示了清晰的与羟化脯氨酸 (Hyp) 残基连接的聚糖密度。这种Hyp重复序列广泛存在于植物与藻类富含Hyp的糖蛋白中。电镜密度分析揭示，其基本单元所具有的典型3 - 4个β- l -呋喃型阿拉伯糖单糖分子 (β-L-Araf3-4) 通过O -连接糖基化与Hyp的羟基共价成键，从而形成缠绕在PPII螺旋周围的高度有序糖鞘结构；其中第一个β-L-Araf与Hyp羟基形成β-1-4糖苷键，其余糖环分子间以β-1-2或者β-1-3键连。连续的聚糖分子与羟脯氨酸PPII螺旋一同形成稳定的结构模块，作为天然生物大分子架构组装的结构基础。

图2. 复杂糖基化修饰介导莱茵衣藻纤毛重要蛋白质复合物组装的分子机制

研究团队对Mst1进行结构模型搭建后，在整个Mastigoneme复合物的中心发现了连续特征性的电镜密度分布，贯穿整个Mastigoneme复合物，并且也显示出大量糖基化的密度。与Mst1-PPII中完全被聚糖包裹的情况不同，这种未知的特征性密度包含四种形式的重复序列，每个重复序列的长度为约19.4 nm，与一个螺旋重复序列的长度一致。

随后，研究人员通过质谱鉴定与序列分析发现，该独特序列在莱茵衣藻蛋白组中仅能匹配到一个含有7,988残基的蛋白，团队将其命名为“纤绒毛轴心蛋白 (Mastigoneme-specific axial protein, Mstax) ”。Mstax含有34个高度糖基化的重复序列片段，研究团队将这一段命名为“Mstax特异性Hyp重复序列 (Mstax-specific Hyp repeat, MHR) ”。

Mstax共含有34个MHR片段，每个MHR包含约64个氨基酸残基，线性串联，跨度约660 nm，与Mastigoneme长度一致。除含有MHR外，AlphaFold 2预测显示，Mstax还具有类似PKD2蛋白的穿膜区，其中PKD2样结构域可能与PKD2蛋白以及SIP（PKD2的相互作用蛋白，充当mstax的VSD结构域S1 helix）形成1:3:1的复合物。AlphaFold-Multimer 预测的结构模型揭示了Mstax、SIP和PKD2的异源复合物组装形式。同时，研究团队还利用CRISPR技术对相应靶点基因进行了敲除功能验证，并使用冷冻电子断层扫描技术(Cryo Electron Tomography, Cryo-ET) 对不同突变体进行了表型观测，进一步验证了复合物组装的假设。

图3. Mastigoneme中聚糖分子的代表性电镜密度

后续针对Mastigoneme进行结构分析发现，聚糖分子直接介导了整个复合物的组装。除了包裹在Mst1纤维和Mstax核心轴的表面外，大量的聚糖分子占据了整个Mastigoneme分子量的20%-25%，并直接参与分子内和分子间堆积的形成，介导了整个复合物的组装。位于Mst1表面的糖类结合模块 (Carbohydrate-Binding Modules, CBMs) 在与PPII螺旋中的阿拉伯糖基相互作用中起着至关重要的作用。具体来说，Mst1的CBM4-6与相邻Mst1分子的PPII螺旋1,854-1,894片段内的阿拉伯聚糖分子形成氢键识别网络。此外，来自Mst1的含二硫键重复模块 (disulfide-bond-containing repeats, SSR) 中，SSR1-8部分与相邻Mst1分子的SSR18-27共同参与了和Mstax一个MHR的Hyp11以及(X2Hyp)6区域聚糖的相互作用。

图4. 阿拉伯聚糖分子介导Mastigoneme复合物的组装

在这项研究中，研究团队综合利用生物物理学、细胞生物学、生物信息学等学科方法，阐释了聚糖分子参与构建生物大分子架构的分子原理。已知植物和藻类具有独特的Hyp O-糖基化形式，其中的聚糖模块主要由阿拉伯糖和少量半乳糖组成。这种依赖Hyp O-糖基化的形式是植物和藻类行使正常生命活动的基础。

此前，学界尚无相关聚糖介导生物大分子架构组装的结构信息，本研究揭示了阿拉伯聚糖在生物结构高阶组装中的关键性作用，从而为理解结构性聚糖分子在生命过程中的角色提供了重要线索，展现了现代结构生物学从结构确证工具到源头创新发现手段的角色转变。该研究为理解复杂天然生物大分子的组装原理提供了坚实的结构基础，同时证明结构生物学工具可以用来揭示糖生物学领域的重要科学问题。

清华大学讲席教授、北京生物结构前沿研究中心研究员、深圳医学科学院创始院长颜宁，清华大学生命科学学院副教授、北京生物结构前沿研究中心研究员闫创业，清华大学生命科学学院教授潘俊敏为本文的共同通讯作者。清华大学生命科学学院2022级博士生黄隽豪、2018级博士生陶慧和2022级博士生陈继坤为本文共同第一作者。清华大学生命科学学院2020级本科生沈扬参与了本研究。清华大学冷冻电镜平台主管雷建林教授为冷冻电镜数据收集提供了帮助。实验的电镜数据采集得到清华大学冷冻电镜平台的支持，实验的质谱鉴定工作得到了蛋白质化学与组学平台的支持，实验的计算工作得到清华大学高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心（北京）的支持。本研究得到了科技部重点研发计划，国家自然科学基金重大研究计划、国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金专项项目、膜生物学国家重点实验室、北京市科技新星计划、北京高校卓越青年科学家计划项目、北京生物结构前沿研究中心与清华-北大生命科学联合中心的经费支持。